TUNEL细胞凋亡检测试剂盒（DAB显色法）

其原理是在末端脱氧核糖核苷酸转移酶（Terminal Deoxynucleotidyl Transferase, TdT）的作用下，在基因组DNA断裂时暴露出的3´-羟基（3´-OH）末端掺入生物素（Biotin）标志的dUTP，随后通过Biotin与连接辣根过氧化酶的链霉亲和素（Streptavidin-HRP）特异结合，在辣根过氧化酶底物二氨基联苯胺（DAB）的存在下，产生深棕色的不溶物，从而特异准确地定位凋亡的细胞。

本试剂盒可用于石蜡切片、冰冻切片和细胞样本（细胞涂片或爬片）的凋亡原位检测，检测结果可在普通光学显微镜下直接观察计数。
包装清单：

产品组成：

保存条件：

Streptavidin-HRP, 4℃, 其余试剂-20 ℃保存，一年有效。

操作步骤：

1、样本处理：

a) 石蜡切片：经二甲笨、酒精脱蜡，复水。脱蜡应充分。

b) 冰冻切片：流水冲洗，去除OCT包埋胶后，用纯水洗3次。

c) 细胞飞片：用组织固定液固定后，用PBS洗三次，每次5分钟。1% Triton X-100处理10分钟，用PBS洗三次，每次5分钟。

2、蛋白酶消化

将1ul 试剂（A）50× Proteinase K稀释于50ul PBS中，滴加到组织上，37℃孵育10-20分钟。消化结束后，用PBS洗三次，每次5分钟。

3、封闭

用3%的双氧水（H2O2）室温封闭10分钟，封闭结束后用PBS洗三次，每次5分钟。

4、阳性对照组织的处理

将组织用DNase I消化，以获得断裂的DNA，即成Tunel染色阳性的对照。阳性对照组织也可以选用小鼠的小肠组织切片。

将50 ul DNase I消化液滴加于组织上，37℃孵育10-30分钟，消化结束后，用PBS洗三次，每次5分钟。

5、连接:

连接反应前用50 ul Equilibration Buffer孵育标本5-10分钟。孵育过程中按下表配制连接工作液。去除标本上的Equilibration Buffer后，直接滴加50ul 连接工作液，37℃孵育1-2小时，染色结束后，用PBS洗三次，每次5分钟。

6、标志

取1 ul 试剂（I）Streptavidin-HRP加入到50ul PBS 中，混匀后滴加至组织上，37℃避光孵育30分钟，随后用PBS洗三次，每次5分钟。

7、显色

取50 ul 试剂（J）DAB-A solution 与2.5 ul 试剂（K）DAB-B solution混匀后，滴加至组织上，室温显色反应30秒至5分钟。显色结束后，用PBS洗三次，每次5分钟

8、苏木素复染

每组织上滴加数滴Mayer’s苏木素染色液，染色1-5分钟，随后用自来水冲洗反蓝，如苏木素染色过深，可用1%盐酸酒精溶液分化数秒，再次反蓝；如苏木素染色过浅，可用苏木素再次染色，并延长染色时间。

9、封片观察

经梯度酒精脱水，二甲苯透明后，滴加中性树胶，加盖玻片封片，光学显微镜下观察拍照。

注意事项：

1、Proteinase K 消化时间需要摸索，冰冻切片 10 min 左右，石蜡切片时间应适当延长。

2、阴性对照体系：配制连接工作液时用纯水替代TdT Enzyme。

3、连接与标志反应时应注意避光。

4、实验过程中请穿戴手套、实验服等，做好个人防护。

备注：

         产品信息可能会有优化升级，请以实际标签信息为准。

本产品仅供科研使用。请勿用于医药、临床诊断或治疗，食品及化妆品等用途。请勿存放于普通住宅区。

为了您的安全和健康，请在实验过程中做好防护工作。